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          禽流感病毒H9亞型血凝抑制試驗抗原

          通用名稱︰禽流感病毒H9亞型血凝抑制試驗抗原    商品名稱︰無    英文名稱︰Avian Influenza Virus(H9 Sub-type)Hemagglutination Inhibition Test Antigen     漢語拼音︰Qinliugan Bingdu H9 Yaxing Xueningyizhishiyan Kangyuan   【主要成分與含量】 抗原為滅活的H9亞型禽流感病毒,血凝效價≧7log2。陽性血清為SPF雞感染禽流感病毒H9亞型制備的高免血清,HI效價≧7log2。陰性血清為SPF雞血清。  【性狀】 抗原為白色或淡黃色海綿狀疏松團塊;陽性血清和陰性血清為微黃色或淡紅色海綿狀疏松團塊。易與瓶壁脫離,加稀釋液後迅速溶解。  【作用與用途】 用于HI試驗檢測禽流感病毒H9亞型抗體。  【用法與判定】  1、材料  1.1  96孔V型(90度)微量反應板、單道及多道微量移液器(配有吸頭)、加樣槽、吸管、燒杯等。  1.2  pH值7.2 0.01mol/L PBS  1.2.1  配制25倍PB  稱量2.74g Na2HPO4 和0.79g NaH2PO4•H2O,加蒸餾水至100ml;  1.2.2  配制1倍PBS  量取40ml 25倍PB,加入8.5g NaCl,加蒸餾水至1000ml;  1.2.3  用NaOH或HCl調pH值至7.2;  1.2.4  69Kpa 15min高壓滅菌或用微孔濾膜過濾除菌。  1.2.5  PBS一經使用,于2∼8℃保存不超過3周。  1.3  阿氏(Alsevers)液  稱葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g,  加蒸餾水至100ml,加熱溶解後調pH值至6.1,69Kpa 15min高壓滅菌,2∼8℃保存備用。  1.4  1%雞紅細胞懸液  采集2∼3只SPF公雞或無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞  的血液與等體積阿氏液混合,用pH值7.2 0.01mol/L PBS液洗滌3次,每次均以3000rpm/min離心5min,洗滌後用PBS配成1%(V/V)紅細胞懸液,2∼8℃保存備用。  1.5  抗原溶解  凍干的抗原和血清均按瓶簽上規格標注的量,用PBS溶解。  2、操作術式  2.1  血凝(HA)試驗  2.1.1  在V型微量反應板中,每孔加0.025ml PBS。  2.1.2  第l孔加0.025ml抗原,反復抽打3∼5次混勻。  2.1.3  從第1孔吸取0.025ml抗原加入第2孔,混勻後吸取0.025ml加入第3孔,如此  進行對倍稀釋至第11孔,從第11孔吸取0.025ml棄去。  2.1.4  每孔加0.025ml PBS。  2.1.5  每孔加入0.025ml 1%(V/V)雞紅細胞懸液。  2.1.6  將反應板在振蕩器上震蕩1∼2分鐘或輕扣反應板混合反應物,在室溫(20∼25℃)下靜置20∼30分鐘或2∼8℃ 45∼60分鐘。在對照孔紅細胞顯著呈鈕扣狀時判定結果。  2.1.7  結果判定  將反應板傾斜60度,觀察紅細胞有無淚珠狀流淌,完全無淚珠樣流淌(100%凝集)的最高稀釋倍數為血凝效價。  2.2  血凝抑制(HI)試驗  2.2.1  根據HA試驗測定的效價,計算配制4個血凝單位(4HAU)抗原。HA效價除以4即為含4HAU抗原的稀釋倍數。例如,HA效價為1:256,則4HAU抗原的稀釋倍數應是1:64(256除以4)。  2.2.2  第1∼11孔加入0.025ml PBS,第12孔加入0.05ml PBS。  2.2.3  第1孔加入0.025ml血清,充分混勻後吸0.025ml于第2孔,依次對倍稀釋至第  10孔,從第10孔吸取0.025ml棄去。  2.2.4  第1∼11孔均加入0.025ml的4HAU抗原,在室溫(20∼25℃)下靜置30分鐘  或2∼8℃ 50分鐘。  2.2.5  每孔加入0.025ml 1%(V/V)的雞紅細胞懸液,震蕩混勻,在室溫(20∼25℃)  下靜置20∼30分鐘或2∼8℃ 45∼60分鐘,對照紅細胞將呈明顯鈕扣狀沉于孔底。  3、結果判定  以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀釋倍數判為該血清的HI效價。當  陽性對照血清的HI效價與已知效價誤差不超過1個滴度,陰性對照血清效價不高于21og2時,試驗方可成立。被檢血清HI效價≦31og2判為陰性;=41og2判為可疑(可疑樣品應重檢,重檢效價≧41og2判為陽性,≦31og2判為陰性);≧51og2判為陽性。