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          禽流感病毒H7亞型(H7N9株)試驗抗原

          通用名  病毒H7亞型(H7N9株)HI試驗抗原

            商品名  無

            英文名  Avian Influenza Virus H7 Subtype (Strain H7N9) Hemagglutination Inhibition Test Antignen 

            漢語拼音  Qinliugan Bingdu H7 Yaxing (H7N9 zhu) Xueningyizhishiyan Kangyuan 

          【主要成分與含量】 抗原為滅活的H7亞型病毒(H7N9株),血凝效價≧7log2。陽性血清為SPF雞感染H7亞型病毒制備的高免血清,HI效價≧7log2。陰性血清為SPF雞血清。

          【性狀】抗原為白色或淡黃色海綿狀疏松團塊;陽性血清和陰性血清為微黃色或淡紅色海綿狀疏松團塊。易與瓶壁脫離,加稀釋液後迅速溶解。

          【作用與用途】 用于HI試驗檢測病毒H7亞型抗體。

          【用法與判定】 

          1、材料

          1.1  96孔V型(90度)微量反應板、單道及多道微量移液器(配有吸頭)、加樣槽、吸管、燒杯等。

          1.2  pH值7.2 0.01mol/L PBS

          1.2.1  配制25倍PB  稱量2.74g Na2HPO4 和0.79g NaH2PO4•H2O,加蒸餾水至100ml;

          1.2.2  配制1倍PBS  量取40ml 25倍PB,加入8.5g NaCl,加蒸餾水至1000ml;

          1.2.3  用NaOH或HCl調pH值至7.2;

          1.2.4  69Kpa 15min高壓滅菌或用微孔濾膜過濾除菌。

          1.2.5  PBS一經使用,于2∼8℃保存不超過3周。

          1.3  阿氏(Alsevers)液  稱葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g,加蒸餾水至100ml,加熱溶解後調pH值至6.1,69Kpa 15min高壓滅菌,2∼8℃保存備用。

          1.4  1%雞紅細胞懸液  采集2∼3只SPF公雞或無禽流感和新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合,用pH值7.2 0.01mol/L PBS液洗滌3次,每次均以3000rpm/min離心5min,洗滌後用PBS配成1%(V/V)紅細胞懸液,2∼8℃保存備用。

          1.5  抗原溶解  凍干的抗原和血清均按瓶簽上規格標注的量,用PBS溶解。

          2 、操作術式

          2.1  血凝(HA)試驗

          2.1.1  在V型微量反應板中,每孔加0.025ml PBS。

          2.1.2  第l孔加0.025ml抗原,反復抽打3∼5次混勻。

          2.1.3  從第1孔吸取0.025ml抗原加入第2孔,混勻後吸取0.025ml加入第3孔,如此進行對倍稀釋至第11孔,從第11孔吸取0.025ml棄去。

          2.1.4  每孔加0.025ml PBS。

          2.1.5  每孔加入0.025ml 1%(V/V)雞紅細胞懸液。

          2.1.6  將反應板在振蕩器上震蕩1∼2分鐘或輕扣反應板混合反應物,在室溫(20∼25℃)下靜置20∼30分鐘或2∼8℃ 45∼60分鐘。在對照孔紅細胞顯著呈鈕扣狀時判定結果。

          2.1.7  結果判定  將反應板傾斜60度,觀察紅細胞有無淚珠狀流淌,完全無淚珠樣流淌(100%凝集)的最高稀釋倍數為血凝效價。

          2.2  血凝抑制(HI)試驗

          2.2.1  根據HA試驗測定的效價,計算配制4個血凝單位(4HAU)抗原。HA效價除以4即為含4HAU抗原的稀釋倍數。例如,HA效價為1:256,則4HAU抗原的稀釋倍數應是1:64(256除以4)。

          2.2.2  第1∼11孔加入0.025ml PBS,第12孔加入0.05ml PBS。

          2.2.3  第1孔加入0.025ml血清,充分混勻後吸0.025ml于第2孔,依次對倍稀釋至第10孔,從第10孔吸取0.025ml棄去。

          2.2.4  第1∼11孔均加入0.025ml的4HAU抗原,在室溫(20∼25℃)下靜置30分鐘或2∼8℃ 50分鐘。

          2.2.5  每孔加入0.025ml 1%(V/V)的雞紅細胞懸液,震蕩混勻,在室溫(20∼25℃)下靜置20∼30分鐘或2∼8℃ 45∼60分鐘,對照紅細胞將呈明顯鈕扣狀沉于孔底。

          3、結果判定  以完全抑制4 HAU抗原的最高血清稀釋倍數判為該血清的HI效價。當陽性對照血清的HI效價與已知效價誤差不超過1個滴度,陰性對照血清效價不高于21og2時,試驗方可成立。被檢血清HI效價≦31og2判為陰性;=41og2判為可疑(可疑樣品應重檢,重檢效價≧41og2判為陽性,≦31og2判為陰性);≧51og2判為陽性。